Markery genetyczne w ampelografii. Winiarze MPW.

W poszukiwaniu rodziców czyli nowoczesna ampelografia

Markery DNA w ampelografii Współczesne metody ampelografii wykorzystujące metody biologii molekularnej pozwalają na identyfikację odmiany winorośli, ustalenie jej odmian rodzicielskich, a ich wyniki praktycznie nie pozostawiają żadnych wątpliwości co do stopnia pokrewieństwa genetycznego. Ma to znaczenie nie tylko w przypadku, kiedy ta sama odmiana występuje pod różnymi nazwami, ale również przy tworzeniu nowych odmian, ich klasyfikacji, jak i ochronie prawnej. Na czym polegają badania genetyczne, rutynowo już dziś stosowane w ampelografii? To nic innego jak mapowanie genomu, czyli "narysowanie" mapy genomowej danego organizmu. Jak każdy rodzaj mapy, również i mapa genetyczna określa obecność i wzajemne relacje jej składników, w tym przypadku pozycje poszczególnych genów w stosunku do określonych wyznaczników, czyli markerów. Na mapie geograficznej takimi wyznacznikami są składniki krajobrazu, jak rzeki czy drogi. W przypadku mapy genetycznej, wyznacznikami mogą być całe geny, jak i określone krótkie charakterystyczne odcinki DNA nie bedące genami, tzw. markery DNA. I to właśnie te drugie mają dziś zasadnicze znaczenie w filogenetyce, a wśród nich tzw. markery drugiej generacji (ang. second generation) oparte na polimorfizmie (wieloodmianowości) genów.

Klasyczna ampelografia opierała się na analizie cech zewnętrznych winorośli (np. barwa czy wielkość liści, owoców), które mogą podlegać zmianom pod wpływem czynników środowiskowych. Stosowana dziś analiza genetyczna oparta jest na analizie sekwencji DNA, która jest stała i niezmienna, niezależnie od tego, gdzie i w jakich warunkach klimatycznych dana odmiana winorośli rośnie. Polega ona na tworzeniu tzw. profili DNA, czyli jakby "odcisków palca" (ang. fingerprint) winorośli. Taki profil DNA określa stopień pokrewieństwa genetycznego i może być użyty np. w dochodzeniu sądowym jako dowód tożsamości odmiany, podobnie jak wyniki analiz DNA są dopuszczane przy ustalaniu sprawców przestępstw kryminalnych lub potwierdzaniu ojcostwa. W sekwencji nukleotydów (A, G, C, T) współtworzących DNA zapisana jest informacja genetyczna, i to właśnie określone sekwencje nukleotydów stanowią istotę markerów DNA. Oznaczenia filogenetyczne polegają w tym przypadku na stwierdzeniu obecności lub braku markera, a w przypadku jego obecności również na jego zmapowaniu - czyli zaznaczeniu punktu jego występowania na mapie genomowej odmiany. Porównując mapy genomowe różnych odmian winorośli, określa się ich wzajemne zależności, ewentualne powiązania genetyczne lub też ich brak. Na przykład w ten sposób Carole Meredith z University of California wykazała, że uznawane wcześniej za różne odmiany Zinfandel, Primitivo, Crljenak Kaśtelanski są identyczne, podobnie jak Charbono i Corebeau. Również badania z użyciem markerów DNA wykazały, że winorośl w Europie jest mało zróżnicowana pod względem genetycznym (9-15% zróżnicowania), sugerując, że uprawiane odmiany winorośli reprezentują jedną kompleksową pulę genową, a ich odmienność wynika raczej z faktu selekcji dokonanej przez człowieka, aniżeli z geograficznego źródła pochodzenia i selekcji naturalnej.

Do przeprowadzenia genetycznej identyfikacji odmiany winorośli potrzebne jest laboratorium posługujące się technikami biologii molekularnej (specjalistyczny sprzęt i odczynniki, pełna sterylność), co w zasadzie jest już bardzo popularne, również w Polsce. Z technicznego punktu widzenia, analizę taką można wykonać dość szybko; jest szansa, że wynik uzyskamy w ciągu kilku dni od rozpoczęcia analizy. Z naszej strony wystarczy, że dostarczymy materiał do badań w postaci np. liścia winorośli, czy też skrawka podkładki - bo również i te możemy w ten sposób zidentyfikować.

Jak przebiega badanie stwierdzające obecność markera i jego lokalizacji? W zależności od typu markera, stosowane są różne podejścia. Stąd też na początku określa się, w kierunku jakich markerów chcemy zbadać genom określonej winorośli. Przy weryfikacji rodzicielstwa czy ustalaniu odmiany wystarczy analiza kilku markerów by uzyskać niepodważalne wyniki. W pracach, gdzie analizie poddaje się kilkanaście lub kilkadziesiąt markerów, celem jest juz raczej ustalenie rodowodu danej odmiany, a nie stwierdzenie samego rodzicielstwa czy weryfikacja genetycznej zgodności odmiany. Dziś w oryginalnych pracach ampelograficznych zasadnicze znaczenie mają wspomniane już markery DNA oparte na polimorfizmie genetycznym, w tym szczególnie: RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism), SSLP (ang. simple sequence length polymorphism) - oparte na polimorfizmie długości prostych sekwencji DNA oraz SNP (ang. single nucleotide polymorphism) - oparte na polimorfizmie punktowym. Powszechna jest również metoda RAPD (ang. random amplification of polymorphic DNA) - losowej amplifikacji (powielania) polimorficznych fragmentów DNA.

We wszystkich tych metodach (poza SNP) w pewnym momencie analizowany DNA jest rozdzielany w polu elektrycznym na żelu agarozowym. Zdjęcia żelów agarozowych z rozdzielonym DNA stanowią częsty element graficzny materiałów promocyjnych firm przeprowadzających testy genetyczne i warto przy okazji uświadomić sobie, co tak naprawdę kryje się pod tymi tajemniczymi obrazkami. W metodzie tej fragmenty DNA jako cząstki elektrycznie nieobojętne wędrują w polu elektrycznym i rozdzielone zostają w zależności od ich wielkości. Żel agarozowy w tym przypadku działa jak grube sito - małe fragmenty łatwo i szybko przechodzą (wędrują) przez nie, podczas gdy duże - o wiele trudniej i wolniej. W efekcie, posegregowane fragmenty DNA tworzą obraz prążkow na żelu, gdzie każdy prążek odpowiada fragmentowi DNA o określonej wielkości. Typowy obraz żelu agarozowego z uwidocznionymi przy użyciu bromku etydyny prążkami DNA rozdzielonymi w polu elektrycznym pokazany jest poniżej (Rys.1):

Badania DNA w ampelografii Rysunek 1: Żele agarozowe (zdjęcia w świetle UV, z archiwum autorki) z rozdzielonym elektroforetycznie (w polu elektrycznym) DNA. Zasada jest prosta - każdy widoczny prążek odpowiada fragmentowi DNA. Kierunek wędrówki prążków jest pionowy (z góry na dół). Prążki znajdujące się najwyżej mają największą długość (wędrują najwolniej), natomiast te najniżej - najmniejszą długość (wędrują najszybciej); prążki znajdujące się na jednym poziomie mają podobną długość sekwencji DNA.

RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism) w tym przypadku można porównać do biometrycznego dowodu tożsamości czy po prostu do biometryki odmiany. Przygotowanie takiej metryki polega na wyizolowaniu z liścia bądź innej części winorośli DNA i pocięciu go odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które mają tą właściwość, że tną DNA w obrębie ściśle określonych miejsc rozpoznawanych przez dany enzym. W efekcie takiego cięcia powstaje cały zbiór fragmentów DNA, których ilość i długość jest charakterystyczna dla danej odmiany. Fragmenty te poddaje się następnie wyżej opisanemu rozdziałowi elektroforetycznemu, wykorzystując właściwość różnej szybkości poruszania się fragmentów DNA w zależności od ich wielkości. W efekcie uzyskujemy wzór osobniczy danej odmiany, tzw. "odcisk palca" w postaci zestawu prążków rozdzielonych na żelu, który swoim wyglądem jest podobny do elektronicznego kodu kreskowego. Analogicznie jak i w kodzie kreskowym, również i w obrazie prążkow DNA na żelu, zakodowane są wszystkie informacje o odmianie, jej pochodzeniu, składzie biochemicznym, skłonności lub oporności do chorób itp. W celu wyszukania charakterystycznej sekwencji DNA, która warunkuje np. cechę odmianową lub podatność na daną chorobę, rozdzielone fragmenty DNA przenosi się na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzuje się z sondami (zsyntetyzowany fragment DNA komplementarny do poszukiwanego fragmentu). Uzyskany obraz prążków DNA porównuje się następnie z obrazem referencyjnym. Obraz RFLP nie bez powodu nazywany jest "odciskiem palca" - jest on ściśle określony dla danego szczepu, i tak jak w przypadku odcisku palca, nie ma dwóch osób o takim samym układzie linii papilarnych, tak nie ma dwóch osobników o takim samym profilu RFLP.

Kolejne metody oznaczeń rodzicielstwa bądź całego drzewa genealogicznego danej odmiany wykorzystują dodatkowo tzw. metodę PCR (ang. polymerase chain reaction) - czyli łańcuchową reakcję polimerazy. To nic innego jak metoda powielania (namnażania) łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych. Kluczową sprawą są tutaj krótkie, laboratoryjnie zsyntetyzowane fragmenty DNA (tzw. oligonukleotydy lub startery, ang. primers), które są komplementarne do sekwencji okalającej powielany w reakcji PCR fragment DNA. W efekcie, dysponując znikomą ilością DNA, możemy go namnożyc do potrzebnych nam ilości. Metoda, za którą Kary Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla, jest dziś rutynowo stosowana w laboratoriach biologii molekularnej na całym świecie, i to głównie za jej sprawą dysponujemy dziś nowoczesnymi markerami genetycznymi, dzięki którym z końcem XX wieku nastąpił prawdziwy przełom w ampelografii.

Marker SSLP (ang. simple sequence length polymorphism) to nic innego jak powtarzający się tandemowo (jeden za drugim) określony motyw sekwencji nukelotydów DNA. Przykładowo, takim motywem może być para czy tez trójka nukleotydów, np. AT, GGT. Same zaś powtórzenia motywów są różnej długości w allelach (odmianach) poszczególnych genów. Wśród SSLP, szczególne znaczenie mają tzw. minisatelity i mikrosatelity (SSR, ang. single sequence repeat), które różnią się długością sekwencji DNA. W przypadku minisatelitów, jednostka powtarzalna (motyw) ma kilkadziesiąt nukleotydów długości (5-60 par zasad), natomiast w przypadku mikrosatelitów jednostka powtarzalna jest krótka, składa się przeważnie z dwu-, trzy- lub czterech nukleotydów, jak np. (AT)n, (GGT)n, (GACA)n. W przypadku minisatelitów liczba powtórzeń motywu wynosi od 2 do 1000, w przypadku mikrosatelitów od 10 do 50. Jako markery DNA, mikrosatelity są bardziej popularne niż minisatelity z dwóch przyczyn. Po pierwsze, minisatelity nie są równo rozprzestrzenione w genomie, częściej znajduje się je na końcach chromosomów (struktura białkowo-nukleinowa, w której upakowane jest DNA), co powoduje że trudniej jest je zlokalizować. Poza tym, technika PCR stosowana do wyszukiwania polimorfizmu z wykorzystaniem markerów SSLP lepiej sprawdza się w przypadku krótszych sekwencji nukleotydowych (do 300 bp, ang. base pair, oznaczających pary zasad DNA) jak mikrosatelity (zwykle do 150 bp) niż dłuższych, jakie potrafi osiągać DNA minisatelitarny (np. setki powtórzeń kilkunastonukleotydowego motywu). Wraz z powstaniem projektu IGGP, (ang. International Grapevine Genome Project, www.vitaceae.org), naukowcy zajmujący się winoroślą mają dostęp do najbardziej popularnych narzędzi bioinformatycznych używanych w tej dziedzinie, jak np. opublikowanych baz danych mikrosatelitów (SSR). Przykładowo, dzięki markerom mikrosatelitarnym John Bowers i Carole Meredith z University of California zidentyfikowali pochodzenie Cabernet Sauvignon, który okazał się być "dzieckiem" Cabernet Franc i Sauvignon Blanc. Jakkolwiek bliskich relacji pomiędzy Cabernet Sauvignon i Cabernet Franc można było się spodziewać, tak bezpośrednie rodzicielstwo Sauvignon Blanc w tym przypadku było pełnym zaskoczeniem.

Markery RAPD (ang. random amplification of polymorphic DNA) - oparte są na losowej amplifikacji (powielaniu) polimorficznych fragmentów DNA przy użyciu reakcji PCR, i tak jak inne wymienione, również i te są wykorzystywane w analizie podobieństwa, wzajemnych relacji i pochodzenia odmian winorośli. W metodzie nie potrzebujemy żadnej znajomości sekwencji DNA analizowanej winorośli, a kluczową rolę odgrywa tu jeden losowo dodany starter oligonukleotydowy o dużej ilości par zasad G i C. Ponieważ DNA różnych szczepów rożni się miedzy sobą, po rodzieleniu na żelu (patrz wyżej) uzyskujemy wzór prążkow DNA charakterystycznych dla każdego z analizowanych szczepów winorośli. Podobieństwo wzorów uzyskanych w tym teście pozwala na ocenę pokrewieństwa badanych szczepów winorośli.

Markery SNP (ang. single nucleotide polymorphism) oparte są na mutacjach punktowych - czyli różnicach w obrębie jednego nukleotydu (!) Zaletą SNP jest ich olbrzymia liczba w genomie, ewolucyjna stabilność (brak zmian z pokolenia na pokolenie), wysoka wydajność identyfikacji i szybkość oznaczenia (oznaczenia przeprowadza się bez analizy w żelu agarozowym). Detekcja SNP jest szybka i odbywa się na zasadzie hybrydyzacji z oligonukleotydami, wykorzystuje tzw. technologię "chip" DNA. "Chip" DNA to nic innego jak płytka z wieloma rodzajami nukleotydów. Wyznakowany znacznikiem fluorescencyjnym testowany DNA nanosi się na płytkę, a ewentualną hybrydyzację ogląda się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pomimo relatywnie wysokich kosztów (ze względu na koszt "chipa", ale i też znaczników fluorescencyjnych), metoda staje się coraz popularniejsza, a w oryginalnych pracach ampelografów jest już rutynowo stosowana. Obecnie dysponujemy już setkami zlokalizowanych markerów SNP w genomie winorośli, które zebrane są w ogólnodostępnych bazach (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), a efektem tego są już dość szczegółowe mapy genomowe Vitis spp. oparte na w/w markerach. Dysponujemy już bardzo szczegółowymi fizycznymi mapami genomowymi dla Cabernet Sauvignon i Pinot Noir (http://genomics.research.iasma.it), jak i wysokiej jakości sekwencją genomu Pinot Noir. Analiza sekwencji Pinot Noir odkryła niezliczoną ilość SNP w obrębie genomu winorośli, a wykorzystanie narzędzi bioinformatycznych (programów komputerowych, baz danych) umożliwia genetyczną analizę porównawczą każdego szczepu, niezależnie od tego czy jego sekwencja genomu jest znana. W bazach genomowych zawarte są również wszystkie dostępne informacje na temat markerów DNA, jak sekwencja, lokalizacja na chromosomie, warunki reakcji PCR w jakich należy przeprowadzić jego analizę. Zbadanie genomu winorośli w kierunku kilku markerów SNP całkowicie wystarczą do określenia pokrewieństwa genetycznego, choć często w pracach ampelograficznych spotyka się badania w kierunku kilkunastu, czy też kilkudziesięciu markerów. Badania takie mają jednak na celu bardziej skonstruowanie już mapy genomowej danego szczepu, w której ilość zlokalizowanych markerów przedkłada się w prostej zależnosci na jej rozdzielczość.

Jakie korzyści z powyższych technik wynikają dla winoroślarzy? Przede wszystkim, dzisiejsza ampelografia praktycznie bez cienia wątpliwości potrafi rozwiązać zagadki jeśli chodzi o rodzaj i pochodzenie szczepów. To samo dotyczy podkładek. Ma to duże znaczenie w rejonach, gdzie winorośl rośnie od lat, jak również na terenach, gdzie dana odmiana została zaadaptowana z innych regionów, i w takich przypadkach często ta sama odmiana występuje pod kilkoma nazwami. Co więcej, określenie pochodzenia winorośli ma ogromne znaczenie w hodowli. Na przykład znaczenie z pozoru nieciekawej odmiany Gouais blanc gwałtownie wzrosło, gdy okazało się, że jest ona, razem z Pinot odmianą rodzicielską w stosunku do wielu ważnych odmian francuskich, w tym do Chardonnay. Badania taksonomiczne stanowią istotne źródło informacji pozwalających zoptymalizować wykorzystanie istniejących zasobów genowych na przykład poprzez wybranie najodpowiedniejszych form do krzyżowań oddalonych. Poza tym wytworzenie nowej odmiany winorośli jest procesem długotrwałym, trwającym kilkanaście lat. Cykl hodowlany można znacznie skrócić prowadząc selekcję z wykorzystaniem markerów DNA. W tym celu wykorzystuje się bezpośrednią analizę DNA bądź też istnienie bliskiego sprzężenia pomiędzy markerem a locus (lokalizacją) odpowiedzialnym za dziedziczenie cechy użytkowej. Metoda ta często jest określana skrótem MAS (ang. marker-assisted selection) i ma szerokie zastosowanie w hodowli winorośli. Na przykład, znając marker sprzężony z genem warunkującym odporność owoców na określone patogeny, można prowadzić selekcję w tym kierunku jeszcze na kilka lat przed wejściem winorośli w pełny okres owocowania (co licząc od posadzenia sadzonki trwa około 5 lat). Ponadto, techniki genetycznej identyfikacji winorośli mogą być bardzo użyteczne, jeśli chodzi o walkę z odmianowym "piractwem". Prawo hodowcy do korzystania z przywilejów własnej odmiany rozciąga się na odmiany pochodne i przy użyciu powyżej opisanych technik również bez problemu można stwierdzić, czy dana odmiana jest rzeczywiście odmianą nową, czy też tzw. pochodną, tzn. zgodną z odmianą wyjściową pod względem istotnych cech. Również i w tym przypadku "odcisk palca" DNA winorośli może być bardzo użyteczny.

(tekst i grafika Daria Słowik)

Dodano 3.03.2009

Poprzednia wiadomość

Następna wiadomość